氧化应激对大鼠真皮成纤维细胞生物学行为的影响

目的:创面微环境中许多细胞都能不同程度的产生活性氧等自由基。观察氧化应激对大鼠真皮成纤维细胞生物学行为的影响,有利于认识创面愈合的机制。方法:实验于2005-09/2006-03在上海市烧伤研究所完成。①实验材料:体质量为200～220g的清洁级雄性SD大鼠,由中科院上海动物实验研究所提供。②实验方法:取SD大鼠背部皮肤组织,消化分离表皮真皮,剪成0.1cm×0.2cm真皮块,置于含体积分数为0.10 FBS的DMEM培养瓶中,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,每周换液2次。约7～10d后,成纤维细胞逐渐从真皮块中迁移出来,并且大量增殖,待原代培养成纤维细胞生长融合成片,用0.05%胰酶-EDTA消化,用含体积分数为0.10FBS的DMEM终止消化,离心后,按1∶3分装传代。取对数生长期的成纤维细胞,培养24h后,分别以20,50,100,150μmol/LH2O2干预成纤维细胞,另设空白对照(不加H2O2)及调零组(只加Hank’s液不加细胞)。③实验评估:采用MTT法观察细胞活力,流式细胞仪观察细胞凋亡,荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测,脂质过氧化物测试盒测试细胞丙二醛含量。结果:①MTT法观察细胞活力:随着H2O2浓度增加,成纤维细胞活力明显降低,各H2O2干预组吸光度值均较空白对照组低(P<0.01)。②流式细胞仪测定细胞凋亡:与空白对照组相比,20μmol/LH2O2干预组细胞凋亡无明显变化,100μmol/LH2O2干预组细胞凋亡明显升高(F=47.78,P<0.01)。③细胞内活性氧的测定:与空白对照组相比,20,100μmol/LH2O2干预组细胞活性氧产生明显升高(F=166.557,P<0.01,P<0.01)。④细胞内脂质过氧化物测定:与空白对照组相比,20μmol/LH2O2干预组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量无明显变化,100μmol/LH2O2干预组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量明显升高(F=5.756,P<0.01)。结论:氧化应激能导致大鼠真皮成纤维细胞细胞活力下降,凋亡增加,抗氧化治疗可以作为难愈性创面的治疗策略。