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携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨
被引：7
作者：
张佑彬
冷希圣
彭吉润
何湘君
吕建峰
翁山耕
王申五
杜如昱
机构：
[1] 北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,北京大学人民医院肝胆外科,,,,,
来源：
关键词：
腺相关病毒;
癌,肝细胞;
基因治疗;
D O I：
暂无
中图分类号：
R73-3 [肿瘤学实验研究];
学科分类号：
100214 [肿瘤学];
摘要：
目的 构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法 以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果 重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论 成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,
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