大肠杆菌属16S rDNA实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank大肠杆菌属16S rDNA基因序列设计并合成PCR引物及针对大肠杆菌属的特异Taqman探针,以大肠杆菌标准菌株的PCR扩增产物作为阳性模板制定标准曲线,建立大肠杆菌属实时荧光定量PCR检测方法。该法Mg2+最佳工作浓度5 mmol/L,探针最佳工作浓度0.12μmol/L,标准曲线相关系数为0.998,能够定量和特异性检测大肠杆菌而与肠道优势菌群的代表种葡萄球菌、双歧杆菌和芽孢杆菌呈阴性反应,检测大肠杆菌16S rDNA基因的灵敏度达40.8 copies/μL。应用建立的方法对20、26、324、1、47、56日龄樱桃谷鸭的气管、食道、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠进行检测结果表明(以每个细菌含1个16S rDNA基因拷贝数计),大肠杆菌属细菌总量,气管内为7.06×107～3.01×108个;食道内为1.73×108～3.23×108个;十二指肠内为2.29×108～2.39×109个;空肠内为1.28×108～1.69×109个;回肠内为1.86×108～1.90×1010个;盲肠内为6.01×108～1.38×109个;直肠内为1.07×108～4.67×1010个。樱桃谷鸭从食道到直肠的大肠杆菌属细菌的数量呈现上升趋势,盲肠和直肠分布量较多。