Mabinlin基因分离与克隆中T－载体技术的应用

从采自云南屏边的马槟榔（ＣａｐｐａｒｉｓｍａｓａｉｋａｉＬｅｖｌ）叶片中分离提纯到ＤＮＡ，依据植物超甜蛋白Ｍａｂｉｎｌｉｎ的氨基酸序列，回译出Ｍａｂｉｎｌｉｎ的核苷酸序列，用简并密码子优先使用的原则和计算机ＤＮＡ系统分析，设计基因的上、下游引物，通过快速扩增得到Ｍａｂｉｎｌｉｎ基因的ＰＣＲ产物。用平末端内切酶ＥｃｏＲＶ和Ｓｍａｌ分别消化质粒Ｂｌｕｅｓｅｒｉｐｔ和Ｐｖｚ－１在标准缓冲液条件下，使用２ｍｍｏｌ／ＬｄＴＴＰ和Ｔａｑ多聚酶，７０℃温育２ｈ，反应中缺乏ｄＴＴＰ以外任何其它核苷酸均可导致线状载体３’端单－Ｔ的增加，此Ｔ－载体可用于Ｍａｂｉｎｌｉｎ基因的分离与克隆。其克隆效率比将ＰＣＲ扩增产物克隆到平末端载体上的效率高出１００倍以上。