小分子G蛋白Rap1 shRNA表达载体的构建和鉴定

被引：3

作者：

郑霞 ^{[1
]}

贺爱兰 ^{[2
]}

叶启发 ^{[3
]}

蒋圣军 ^{[4
]}

机构：

[1] 荆州市中心医院妇产科

[2] 湖南人文科技学院生命科学系

[3] 中南大学湘雅三医院卫生部器官移植中心

[4] 北京市垂扬柳医院,北京市微创医院

来源：

生命科学研究 | 2009年 / 13卷 / 02期

关键词：

Rap1; siRNA; shRNA; 小鼠肝细胞;

D O I：

10.16605/j.cnki.1007-7847.2009.02.017

中图分类号：

R346 [];

学科分类号：

摘要：

应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rap1基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列,设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(EGFP)的pGenesil-3载体,构建Rap1 shRNA表达载体;经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20g,随机分成4组:Ⅰ组(转染HK组)﹑Ⅱ组(转染Rap1 shRNA1组)﹑Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)﹑Ⅳ组(转染Rap1 shRNA3组).于0﹑16﹑24h腹腔内注射Rap1 shRNA2.0～2.5mg/kg(用PBS稀释至1mL);48h后收集小鼠肝脏,用显微荧光﹑定量RT-PCT﹑免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率﹑Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组﹑Ⅱ组﹑Ⅲ组﹑Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组﹑Ⅲ组﹑Ⅳ组的Rap1 mRNA表达﹑Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.

引用

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