四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

被引：43

作者：

张驰宇

张高红

杨敏

贲昆龙

机构：

[1] 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室

来源：

中国生物化学与分子生物学报 | 2004年 / 03期

关键词：

引物二聚体; 荧光实时定量RT-PCR; SYBR greenⅠ; 四步法; RNA定量;

D O I：

10.13865/j.cnki.cjbmb.2004.03.023

中图分类号：

Q503 [生物化学技术];

学科分类号：

摘要：

为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 ,并可成功地用于低丰度RNA的准确定量

引用

页码：387 / 392

页数：6

共 8 条

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