AAV-hVEGF165及AAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞的实验研究

目的探讨应用hVEGF165与TGFβ1基因逆转椎间盘退变的可行性。方法用分子克隆技术,从pcDNA3(+)-hVEGF165获得hVEGF165cDNA,并克隆至AAV包装质粒pSNAV上,构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒。经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导pSNAV-hVEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞。荧光免疫组化方法检测hVEGF165蛋白,并用MTT法测定hVEGF165对血管内皮细胞增殖的影响。由本元正阳公司对pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染退变的椎间盘纤维环细胞,Westernblot检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hVEGF165构建完成,荧光免疫组化显示hVEGF165蛋白表达,MTT法显示hVEGF165蛋白对血管内皮细胞增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV-hVEGF165,AAV-hVEGF165构建成功。Westernblot显示hVEGF165与TGFβ1在纤维环细胞中表达,AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1双基因联合转染的纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量较hVEGF165与TGFβ1基因各自单独转染的细胞Ⅰ型胶原表达量明显增多。结论hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进退变纤维环细胞Ⅰ型胶原表达增加。