卵母细胞扫描电镜和透射电镜样本的制作(摘要)(英文)

被引:4
作者
武彩红 [1 ,2 ]
张斌 [1 ]
郑筱峰 [1 ]
芮荣 [3 ]
戴建军 [4 ]
机构
[1] 江苏畜牧兽医职业技术学院
[2] 江苏姜曲海种猪场
[3] 南京农业大学动物医学院
[4] 上海农业科学院畜牧兽医研究所
关键词
卵母细胞; 扫描电镜; 透射电镜; 超微结构;
D O I
10.16175/j.cnki.1009-4229.2009.05.044
中图分类号
S814 [畜禽繁殖];
学科分类号
090501 ;
摘要
[目的]探讨卵母细胞扫描电镜和透射电镜的制作方法,为相关研究提供技术支持。[方法]以猪GV期和体外成熟MII期卵母细胞(抽吸法采集)为研究对象。①扫描电镜样本制备:供试GV期和MII期卵母细胞于PBS(pH值7.4)中清洗后,部分转入0.1%透明质酸酶中,38.5℃孵育15min,微吸管吹打去除卵丘细胞(CC),即获得无卵丘细胞的卵母细胞,用以观察卵母细胞外透明带(ZP)结构;取去除卵丘细胞的部分卵母细胞,经PBS液洗后,再置于0.5%链霉蛋白酶中,在实体显微镜下观察,待透明带溶解时,小心地将卵母细胞转入PBS中,即获得了无透明带的卵母细胞,用以观察卵母细胞膜表面的微绒毛(Mv)。未去除卵丘细胞的卵母细胞、去除卵丘细胞的卵母细胞及去除透明带的卵母细胞分别经PBS洗2~4次后,于2.5%戊二醛中4℃固定6h,再经PBS清洗3次,每次30min;再于1%锇酸中固定1.5h,然后再经PBS清洗3次,每次30min;之后,用乙醇逐级(30%、50%、70%、90%、100%、100%)脱水,每级20min;样品脱水后,用乙酸异戊脂置换;置换后的样品直接移到样品台上,再放入临界点干燥仪干燥,粘台,IB-5离子溅射仪喷金,置于扫描电子显微镜下观察、拍照。②透射电镜样本制备:供试卵母细胞也经PBS清洗,戊二醛固定,琼脂包埋后锇酸固定,乙醇脱水,步骤基本同上,只是最后用环氧丙烷置换。脱水后的样品于Epon-812树脂和丙酮等体积混合液中渗透4h,再在纯Epon-812中渗透过夜;然后将样品包埋,放入聚合器中聚合(35℃,24h;45℃,24h;60℃,48h);聚合后的样品在实体显微镜下修块,半薄切片定位,重新包埋,LKB-V超薄切片机切片;超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色,样品自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照。[结果]电镜下观察到的细胞形态结构完好,超微结构清晰。扫描电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞紧密包围在卵母细胞外,微绒毛呈致密状垂直于卵膜表面,透明带呈不规则的蜂窝状,有小梁突起。在体外成熟MII期卵母细胞中,卵丘细胞变得松散,卵母细胞表面的微绒毛结构显得更光滑,透明带呈不规则的蜂窝样,但蜂窝状结构增多,且小梁突起更明显。透射电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞在透明带周围紧密排布,并有大量突起伸入透明带中;卵母细胞微绒毛数量较多、相对较长,且也伸入透明带中;线粒体呈圆形,多为横嵴并清晰,成簇分布于皮质区;脂滴以两种不同形式存在于大部分细胞质内,一种呈均质状,另一种不均质且有透亮条纹,两种形式的脂滴常相邻存在,并以均质脂滴居多。脂滴外包有不连续的滑面内质网;高尔基体发达,由多层扁平囊泡及大小泡组成;在MII期卵母细胞中,卵丘细胞间缝隙连接增大,出现了明显的卵周隙;与培养前卵母细胞相比,微绒毛相对较短、较粗,且从ZP内撤回;线粒体体积增大,仍成簇伴随着脂滴分布;脂滴仍以两种不同形式存在,但以不均质脂滴居多;不均质脂滴呈球状,且上透亮条纹增多,电子密度更高;皮质颗粒位于卵质膜下,呈单层排列。[结论]证实该方法适用于卵母细胞超微结构观察的制样,另外,此法也适用于休积小、数量少、游离细胞的电镜样本制备。
引用
收藏
页码:110 / 112+188 +188
页数:4
相关论文
共 4 条
[2]   4种不同品种石榴的叶表皮特征电镜扫描观察(英文) [J].
徐迎碧 ;
丁之恩 .
Agricultural Science & Technology, 2008, (03) :99-102
[3]   细胞松弛素B对鲍受精卵超微结构的影响 [J].
孙振兴 ;
王如才 ;
姜明 ;
刘晓云 .
动物学杂志, 2002, (05) :14-17
[4]  
Zona Reaction in Porcine Oocytes Fertilized In Vivo and In Vitro as Seen with Scanning Electron Microscopy1[J] . Hiroaki Funahashi,Hans Ekwall,Heriberto Rodriguez-Martinez.Biology of Reproduction . 2000 (5)