体外培养骨髓基质细胞向成骨细胞的分化

背景:目前如何有效地诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,建立稳定的体外培养诱导模式,研究诱导条件的作用机制是骨组织工程研究的重点。目的:建立一种兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的体外培养体系,观察其成骨过程。设计:对比观察。材料:4～8周龄新西兰大白兔,雌雄不拘,用于骨髓基质细胞的原代与传代培养。方法:将兔股骨骨髓基质细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底近80%后,加入2.5g/L胰蛋白酶消化传代培养。取生长良好的对数期第2代细胞,以1×108L-1的细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔培养板内。细胞分为2组,实验组使用条件诱导培养基(RPM1640标准培养基加入地塞米松10-8mol/L,β-甘油磷酸钠10mmol/L,维生素C50μg/L),对照组继续使用标准培养基。两组细胞持续培养(常规两三天换液1次)进行细胞成骨分化观察。主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞生长及形态变化;苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、钙结节染色及扫描电镜观察骨髓基质细胞形态变化。结果:经诱导培养的细胞,在体外逐渐转化、增殖、分泌细胞外基质、最终形成了矿化基质。苏木精-伊红染色显示实验组传代细胞在接近融合为单层时形态多为梭形,多角形等。胞浆内可见颗粒;碱性磷酸酶染色可见实验组传代细胞染色呈强阳性,阳性率达83.2%,并能大量分泌Ⅰ型胶原;对照组仅有个别细胞染色呈阳性。四环素染色观察实验组骨髓基质细胞形成金黄色钙结节,甚至是骨样组织,与典型成骨细胞的生物学特性相似。扫描电镜观察实验组培养的传代细胞已接近融合为单层,细胞呈梭形或多角形表现,细胞表面及细胞间可见钙盐结晶沉积。结论:实验所建立的兔骨髓基质细胞体外诱导成骨转化体系,能够培养出生长活跃,增殖迅速,稳定、多量向成骨细胞转化的骨髓基质细胞培养模式,所培养的细胞可作为成骨细胞的一种来源,为构建组织工程化骨提供种子细胞。