金葡菌P-V杀白细胞毒素的原核表达及对人多形核白细胞的杀伤效应(英文)

目的:通过基因工程方法获得重组的杀白细胞毒素,为深入研究其致病机制打下基础。方法:利用PCR方法从产杀白细胞毒素金葡菌临床分离株的基因组DNA中克隆PVL-S和PVL-F基因序列,分别将其克隆到载体pET22b中,构建重组pET22b-LuKS和pET22b-LuKF原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,异丙基硫代β-D半乳糖苷(sopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,将其可溶性表达经镍离子螯合亲和层析纯化后,通过对外周血粒细胞和多形核白细胞的刺激反应鉴定其活性。结果:以PCR方法获得PVL-S和PVL-F基因片段,与克隆载体连接后测序与文献报道的基本一致,成功构建了pET22b-LuKS和pET22b-LuKF原核表达质粒,并高效诱导表达出相对分子质量约34 kD的S蛋白及相对分子质量约35 kD的F蛋白。重组蛋白(rPVS,rPVF)在37℃经IPTG诱导时均以包涵体形式存在,而30℃时部分出现可溶性表达,部分为包涵体。将上清可溶性重组蛋白作用于外周血粒细胞,可导致粒细胞出现凋亡,部分出现坏死。结论:成功构建了表达载体pET22b-LuKS和pET22b-LuKF,对其编码的S片段和F片段进行了原核表达和鉴定,高效表达了杀白细胞毒素的S和F两类蛋白,为进一步对其致病机制和免疫原性的研究奠定基础。