NGAL对肾小管上皮HK-2细胞的缺氧与复氧损伤保护作用题录附视频

目的探究NGAL对肾小管上皮HK-2细胞缺氧与复氧损伤的作用及其机制。方法以HK-2细胞为模型,体外模拟缺氧与复氧环境(缺氧时氧浓度<0.1%)。先用WB和实时定量RT-PCR检测正常对照组、缺氧与复氧组细胞内NGAL蛋白和基因水平。用噻唑蓝(MTT)法和磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶双染法检测并比较缺氧与复氧同时加入不同浓度NGAL(20、100、200、400、1 000 ng/ml)处理组、正常对照组、缺氧与复氧组细胞增殖和凋亡情况,确定加入重组NGAL的适宜浓度。用流式细胞术和实时定量RT-PCR检测并比较正常对照组、缺氧与复氧组、缺氧与复氧同时加适宜浓度NGAL组细胞周期及凋亡相关基因bax、bcl-2、caspase-3。平行实验重复3次,比较各组检测结果。结果 WB法检测细胞内NGAL蛋白/肌动蛋白缺氧与复氧组为5.88±0.08,与正常对照组(1.51±0.03)比较差异有统计学意义(t=96.89,P<0.05)。RT-PCR法检测NGAL/肌动蛋白基因水平缺氧与复氧组为12.32±1.27,正常对照组为1.00±0.00,两组差异有统计学意义(t=15.40,P<0.05)。MTT结果正常对照组吸光度(A)值为0.97±0.03,缺氧与复氧组为0.56±0.04,两组差异有统计学意义(t=18.68,P<0.05)。缺氧与复氧同时加入不同浓度的NGAL(50、100、200、400、1 000 ng/ml)组A值分别为0.56±0.04、0.53±0.03、0.56±0.04、0.53±0.03、0.54±0.02,缺氧与复氧组和不同浓度NGAL处理组间A值水平相近,差异无统计学意义(F=0.978,P>0.05),但其与正常对照组比较A值差异均有统计学意义(F=105.20,P<0.05)。Annexin V-FITC/碘化丙啶双染检测细胞早期凋亡率(Annexin V阳性,碘化丙啶阴性的细胞群),正常对照组为(1.0±0.2)%、缺氧与复氧组为(27.6±1.4)%,两组细胞早期凋亡率差异有统计学意义(t=33.590,P<0.05);加入重组NGAL 50、100 ng/ml后分别为(27.8±1.1)%、(26.4±1.3)%,和缺氧与复氧组比较,其差异无统计学意义(t分别为0.250、1.520,P均>0.05);加入NGAL 200 ng/ml组为(19.4±0.6)%,明显低于缺氧与复氧组,且早期凋亡率差异有统计学意义(t=10.350,P<0.05);而NGAL400、1 000 ng/ml组为(19.3±1.1)%、(18.9±0.5)%,与NGAL 200 ng/ml组间早期凋亡率差异均无统计学意义(t分别为0.130、0.630,P均>0.05);因此选取NGAL浓度为200 ng/ml。流式细胞术检测PI正常对照组为(30.2±0.4)%,而缺氧与复氧组下降至(22.1±2.7)%,两组PI差异有统计学意义(t=3.750,P<0.05),而缺氧与复氧同时加入NGAL 200 ng/ml组PI为(23.2±3.7)%,和缺氧与复氧组比较,差异无统计学意义(t=0.510,P>0.05)。实时定量RT-PCR法检测各组细胞内bax/bcl-2、caspase-3基因水平,正常对照组分别为1.00±0.00、1.00±0.00,缺氧与复氧组为5.83±0.33、8.13±0.20,加入NGAL 200 ng/ml后为2.52±0.07、1.89±0.02,三组bax/bcl-2(F=485.30,P<0.05)和caspase-3基因水平(F=3 456.78,P<0.05)差异有统计学意义。结论 NGAL在缺氧与复氧损伤的肾小管上皮HK-2细胞中通过调节凋亡相关基因表达发挥抗凋亡作用,且为缺血再灌注致急性肾损伤治疗提供了新思路和实验室依据。