副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建

目的　构建含副溶血弧菌 (vibrioparahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体 ,检测并鉴定表达载体在转化菌的表达 ,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素 (TLH)的功能奠定基础。方法　根据Gen bank的tlh全基因序列 ,设计一对附加EcorⅤ和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物 ,以VP基因组DNA为模板 ,用高保真Taq酶扩增出tlh基因。连接pGEM -T载体构建克隆载体 ,测序鉴定后 ,再用EcorⅤ和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体 pET32a+,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒 ,转化DE3 ,IPTG诱导 ,用SDS -PAGE检测tlh的表达。结果　扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有 99%的同源性 ,重组表达载体转化DE3 ,能表达融合蛋白。结论　本研究成功扩增出完整的tlh基因 ,构建了克隆载体和表达载体 ,获得融合表达的目的蛋白。