不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞三维培养下成软骨能力的影响

背景:软骨组织工程要求植入的软骨细胞在三维支架材料中能够合成与软骨相同的软骨基质,而植入密度是成功的关键点之一。目的:探讨壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架上不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨能力的影响。设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2007-11/2008-07在中国医科大学细胞生物实验室完成。材料:清洁级雄性SD大鼠6只,由中国医科大学实验动物中心提供。方法:室温下以乙酸为溶剂的5g/LⅠ型胶原溶液与20g/L壳聚糖按7∶3体积比置于预冷的模具中混合,冷冻干燥后将支架切成5mm×5mm×2mm,浸入含20g/L硫酸软骨素的乙醇中室温交联,双蒸水冲洗至中性,再次冷冻干燥即为壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架。切取大鼠腹股沟脂肪组织,通过胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪间充质干细胞。将制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架分为3组,分别调整第3代细胞密度为2×109L-1,2×1010L-1,2×1011L-1,吸取细胞悬液50μL均匀的种植于每个支架上,加入成软骨诱导培养基培养3周。主要观察指标:取样制成切片进行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,RT-PCR检测软骨特异性基因的表达。结果:诱导培养3周后,各组细胞在支架中生长黏附良好,且高种植密度2×1011L-1组细胞排列紧密,有较多的基质形成,并有软骨陷窝样结构;各组Ⅱ型胶原均呈阳性表达,并随细胞种植密度的升高呈递增趋势。RT-PCR结果显示,随着细胞种植密度的升高,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达逐渐增强,而Ⅹ型胶原mRNA的表达逐渐下降。结论:壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,2×1011L-1高密度种植有利于脂肪间充质干细胞的成软骨分化。