产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）Ｅ２６（ｐＭＣ７３Ａ）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌ｈｒｐ基因簇的重组粘粒ｐＣＰＰ４３０导入Ｅ２６ （ｐＭＣ７３Ａ）。接合子在番茄叶片上出现与对照 ＤＨ５ （ｐＣＰＰ４３０）一样典型的过敏反应症状，而出发菌 Ｅ２６（ｐＭＣ７３Ａ）则没有过敏反应；从接合子中抽提到２条质粒 ＤＮＡ带，一条与 ｐＣＰＰ４３０位置相同，大小约 ５０ｋｂ，另一条与ｐＭＣ７３Ａ位置相同，大小约 ７ｋｂ；接合子质粒 ＤＮＡ的酶切图谱正好是ｐＣＰＰ４３０和ｐＭＣ７３Ａ酶切图谱的叠加；用地高辛标记的ｈｒｐＮ　ＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌 Ｅ２６ （ｐＭＣ７３Ａ）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定，均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。