PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株

采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料，分离原生质体，在原生质体培养基中作液体浅层暗培养，植板率为５％，植株再生频率为１００％。作者进而开展了遗传转化研究。为研究ＰＥＧ介导转化诸葛菜原生质体的影响因素，通过瞬间表达，实验了ＰＥＧ法转化子叶原生质体的过程，在此基础上将分离纯化后的原生质体与带ＨＰＴ基因的质粒ＤＮＡ（ｐＢＩ２２２）混合，ＨＰＴ基因作选择标记，ＰＥＧ介导转化；重新收集转化后的原生质体，以５×１０４／ｍｌ的密度在原生质体培养基中作浅层培养；培养１０—１５天后用２５ｍｇ／Ｌ的潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）进行筛选，一月后出现少量细胞团，转入含潮霉素５０ｍｇ／Ｌ的扩增培养基扩增愈伤组织，进而转入含５０—１００ｍｇ／Ｌ潮霉素的分化培养基诱导分化成苗，分化率为１００％，转入生根培养基中生根成完整植株。抗性植株再生率为４×１０（－５）。在获得再生转基因植株后，以再生植株叶片为材料，进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交，证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达，再生转基因植株频率为１０（－５）。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。