外源性人胰岛素样生长因子-1基因在关节软骨细胞中的表达

目的探讨含有绿色荧光蛋白(GFP)的外源性人胰岛素样生长因子(hIGF)1基因真核表达载体在关节软骨细胞内稳定表达的可行性,建立IGF1基因工程化的关节软骨细胞。方法利用基因重组技术,将GFPcDNA片段插入pcDNA3.1hIGF1载体中,构建重组载体pcGI。然后采用脂质体方法,转染原代关节软骨细胞,经G418筛选后,继续体外单层培养4周。原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF1的表达,荧光显微镜观察GFP的表达,Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测软骨细胞表型,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测软骨细胞增殖能力。结果根据重组载体pcGI内的酶切位点,设计采用BamHI酶切显示为线性化,XbaI酶切显示为512bp、1768bp、5915bp三个片段,HindⅢ则酶切下3023bp、5172bp二个片段,证明所构建的质粒方向及大小正确,含有GFP和hIGF1cDNA片段。稳定转染pcGI的软骨细胞原位杂交、免疫细胞化学和荧光显微镜证实了hIGF1和GFP的表达,同时MTT显示转染后的软骨细胞增殖能力增强,并能维持Ⅱ型胶原的表达。结论外源性hIGF1和GFP基因在关节软骨细胞内获得稳定表达,体外单层培养的转染关节软骨细胞增殖能力增强,同时维持软骨细胞表型。