转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cry1Ac基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用。目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道。为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测方法。所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态。建立的MON757转化体特异性的q RT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝。用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体。采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用q RT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定。结果表明,有1份含量在1.5%左右,4份含量超过了20%,两种方法的测定结果基本一致。本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和q RT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值。