FasL基因转染诱导类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究

目的通过构建FasL重组质粒并转染原代培养的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞,研究FasL基因对体外培养的RA滑膜细胞的凋亡诱导作用,寻找针对R A关节腔内基因治疗的有效靶基因。方法采用反转录-聚合酶链反应(R T-PCR)方法扩增FasL cD NA全长片段,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,将FasL基因导入真核表达载体pcDN A3.1-neo;体外原代培养RA患者及正常人的滑膜细胞;脂质体包裹真核表达质粒pcD NA3.1-FasL及空质粒pcDN A3.1-neo,分别转染处于指数生长期的RA患者及正常人的滑膜细胞;经G418筛选,采用形态学、TUNEL法及AnnexinⅤ/碘化丙啶(PI)染色等方法检测各组滑膜细胞的凋亡情况。结果FasL基因原核及真核重组质粒载体顺利构建,基因序列检测结果与国外报道完全一致;RA患者及正常人的滑膜细胞原代培养、传代顺利完成;RA患者滑膜细胞转染FasL重组质粒(rhFasL)15h后,光镜下可见大量细胞体积缩小、扭曲、变形,胞核中出现颗粒样物质,少数细胞脱落底壁,G418筛选2周后仅有1￣2个/低倍视野细胞存活,且生长相对静止;RA患者滑膜细胞在转染空质粒及正常人滑膜细胞在转染pcDNA3.1-FasL及空质粒后仅有少数细胞变形、反光度下降,很少脱离底壁,G418筛选2￣4周后细胞再次生长并形成克隆;经TUNEL方法检测可见大量转染rhFasL的RA滑膜细胞的