日本血吸虫重组抗原SjPGAM-SjEnol的保护性免疫效果评价

目的构建日本血吸虫重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol并在大肠埃希菌(E.coli BL21)中表达,观察重组抗原在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol富含人源(HLA)Ⅱ类、鼠源(H2-d)Ⅱ细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段,将对应编码的核苷酸序列进行拼接,构建重组质粒pET32a(+)-SjPGAM-SjEnol,并在E.coli BL21中表达。用蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组抗原的抗原性。用小鼠实验评估重组抗原的免疫保护效果,即将55只雄性BALB/c小鼠均分成5组,其中3个试验组分别用重组抗原pET32a-SjPGAM-SjEnol(A组)、pET28a-SjPGAM(B组)、pET28a-SjEnol(C组)(各27μg)与206佐剂混合后免疫小鼠,每次间隔2周,共免疫3次。同时设佐剂对照组(D组)和空白对照组(E组)。末次免疫后2周,每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染后6周,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝虫卵数(EPG),计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周尾部取血和剖杀时收集血清,应用ELISA检测血清特异性IgG抗体水平。结果确定SjPGAM的96～147、SjEnol的233～312肽段为重组片段。PCR扩增出一条含编码这两个肽段的核苷酸序列的重组DNA序列,大小447bp。获得的重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol相对分子质量(Mr)为33000。Westernblotting结果显示,该重组蛋白可被日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清识别,具有良好的抗原性。小鼠免疫实验结果显示,与空白组相比,A组获得39.7%的减虫率和64.9%的肝减卵率,其减虫率与B组(18.5%)、C组(14.7%)比较,差异有统计学意义(均P<0.05);肝减卵率与B组(47.5%)、C组(30.5%)比较,差异也有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。ELISA结果显示,第3次免疫后A组的特异性IgG抗体达到较高水平(2.372±0.268),与D组(0.490±0.138)、E组(0.220±0.088)间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol,多表位重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol在小鼠抗血吸虫感染中比单一重组抗原pET28a-SjPGAM和pET28a-SjEnol诱导了更高的免疫保护作用。