慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径对小麦的导入及转基因植株分析

慈菇蛋白酶抑制剂（ArrowheadProteinaseInhbitor，API）是来源于慈菇（Sagittariatrifolia）储藏器官（根茎）的一种天然抗虫物质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类，能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶，对某些鳞翅目、双翅目以及鞘翅目等昆虫有毒杀作用。通过花粉管途径，将构建的含抗虫基因API－A、API－B和选择性标记基因NPT－Ⅱ的质粒pBLAH－A（B）导入3个冬小麦品种（JD-1、8866、866554），通过卡那霉素抗性的筛选和聚合酶链反应（PCR）技术分析表明，Kmr绿苗中有3株为PCR阳性株（866554有2株，JD-1有1株），阳性率为0．29％。用API基因的片段为探针，对Kmr绿苗分别进行基因组DNA的Southern杂交分析，在3株PCR阳性株中都检测出了API基因片段的存在，说明了外源目的基因已整合到小麦基因组中。对转化阳性植株899554-3的自交后代进行了PCR分析和Southern杂交分析，部分植株表现为PCR和Southern杂交阳性，这表明整合到基因组中的外源基因能稳定遗传给后代。用ELISA的方法检测与API基因融合的NPT－Ⅱ基因的表达含量，发现在PCR和Southern杂交分析为阳性反应的3植株中都显示出NPT－Ⅱ的高含量，为杀虫基因API在转基因小麦中的整合提供了进一步证据。