紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRI限制酶部分酶解,通过10—50%蔗糖梯度离心,分离到20—30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱奇主载体——pLAFR1质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌1021菌株中8.7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E.coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌合成培养基(SM)上选择接合转移子。将得到的所有接合转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结癌基因的重组质粒pRaZ15。将该质粒用EcoRI完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。