正常和链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠体外破骨细胞样细胞的培养方法

目的:建立成年正常大鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨髓体外破骨细胞样细胞培养的方法。方法:实验于2003-05/2004-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。①雌性Wistar大鼠,2.5～3.0个月龄,用链脲佐菌素溶液,按60mg/kg单剂量进行腹腔注射,注射48h后检测血糖,血糖≥16.7mmol/L视为诱导糖尿病模型成功。随机选择链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠及成年正常大鼠各1只,麻醉下处死,无菌条件下取股骨,收集骨髓。②用α-MEM冲洗骨髓细胞,并稀释骨髓细胞至1.5×109L-1的浓度,将细胞悬液置于24孔培养板内,培养液为无酚红α-MEM,其中含体积分数为0.1的胎牛血清、30μg/L细胞核因子κB受体活化因子配基、10μg/L巨噬细胞集落刺激因子。培养板置于体积分数为0.05的CO2和37℃培养箱内培养,用倒置相差显微镜观察破骨细胞样细胞形态变化。③细胞培养7d后,进行细胞固定和抗酒石酸酸性磷酸酶染色,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性且细胞核≥3个的细胞认定为破骨细胞样细胞。④在倒置显微镜下,计数破骨细胞样细胞数。结果:①倒置显微镜下动态观察细胞,发现细胞的形态逐渐由圆形变为椭圆形、长梭形和不规则形状。在培养的第3天始,单核细胞融合为多核细胞,破骨细胞样细胞形成。在第5,6天破骨细胞样细胞形成明显增多。②破骨细胞样细胞酶学检查,可见有大量多核且抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的细胞。③破骨细胞样细胞计数:实验获得的破骨细胞样细胞的数量能够满足细胞计数的需要,与成年正常大鼠相比,链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠破骨细胞样细胞数量增加(92.50±10.87,107.00±13.72个/孔)。结论:正常成年大鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨髓体外破骨细胞样细胞的培养方法建立,分离培养的破骨细胞样细胞有多核、抗酒石酸酸性磷酸酶阳性的特性。