参芪脑保含药血清在体外培养PC12细胞抗凋亡作用中的量效分析

目的:观察在经典药方补阳还五汤基础上加减而成的参芪脑保对体外培养的正常PC12细胞增殖和对抗活性氧(100μmol/L过氧化氢)引起的细胞凋亡作用,分析该作用的量效关系。方法:实验于2002-09/2003-04在解放军总医院老年医学研究所老年医学实验室完成。①含药血清制备:选用3月龄SD大鼠,随机分为4组:对照组,参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,每组12只。参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组:将参芪脑保颗粒剂(成分:黄芪、丹参、当归尾、桃仁、红花、川芎、赤芍、地龙,10g/包,由解放军总医院制剂室提供,批号000831)按6.4,3.2,1.6g/kg剂量溶于2mL蒸馏水中灌胃;对照组:给予等量蒸馏水。各组连续灌胃7d后腹主动脉取血分离含药血清。②参芪脑宝对正常细胞增殖的影响:采用大鼠PC12细胞作为体外神经细胞模型。将对数生长期细胞接种于96孔培养板,将细胞随机分为4组:对照组和参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,分别加入含体积分数0.1各组相应含药血清的DMEM培养液,分别于培养24,60和86h进行细胞计数。③参芪脑保抗活性氧引起的细胞凋亡作用:将对数生长期细胞培养24h。将细胞随机分为5组:对照组、过氧化氢损伤组和过氧化氢+参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,除对照组外,其余各组均用含过氧化氢(终浓度100μmol/L)和20g/LB27的无血清DMEM培养基处理30min,过氧化氢损伤组和氧化损伤组改用含体积分数0.1的对照组血清培养基,参芪脑保各剂量组改用相应的含药血清培养基继续培养48h。④采用四氮唑蓝比色法测定正常细胞增殖和活性氧损伤后细胞存活数;采用流式细胞仪和DNAladder法观察细胞凋亡及参芪脑保抗凋亡作用及其剂量效应关系。⑤多组间差异采用方差分析,根据方差齐性结果,采用非配对t检验作两组间比较。结果:①参芪脑保对正常细胞增殖的影响:与对照组相比,参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组在培养24,48和86h时均能明显提高正常PC12细胞的存活数(P<0.01),但无明显剂量效应关系。②参芪脑保对活性氧损伤后细胞存活数的影响:过氧化氢损伤组的细胞存活数明显低于对照组(P<0.01),除了过氧化氢+参芪脑保1.6g/kg组外,过氧化氢+参芪脑保6.4,3.2g/kg组细胞存活数明显高于过氧化氢损伤组(P<0.01)。③参芪脑保对活性氧损伤后细胞凋亡率影响:过氧化氢损伤组的细胞凋亡率明显高于对照组,除过氧化氢+参芪脑保1.6g/kg组外,过氧化氢+参芪脑保6.4,3.2g/kg组细胞凋亡率均明显低于过氧化氢损伤组(P<0.01)。④参芪脑保对活性氧损伤后细胞DNA片断化的影响:过氧化氢损伤组细胞的DNA片断化明显增强,过氧化氢+参芪脑保3.2g/kg组也可见轻度DNAladder现象,但过氧化氢+参芪脑保3.2g/kg和6.4g/kg组的DNAladder则明显减弱甚至消失,说明有明显的剂量效应关系。结论:参芪脑保对正常培养PC12细胞具有明显促进增殖作用,并在较高剂量下能显著对抗过氧化氢引起的细胞存活率降低、细胞凋亡率增高和DNA片断化,表明参芪脑保具有明显的神经保护作用,其机制可能与抗氧化反应有关。