颈髓损伤后生长相关蛋白43及内皮素1mRNA表达与血脊髓屏障的损害

目的:探讨颈髓损伤后生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA表达与血脊髓屏障损害的关系。方法:实验于2004-09/2005-03在郑州大学基础医学院人体解剖学教研室神经分子生物学实验室完成。选择健康雄性wistar大鼠60只制作脊髓损伤模型,随机分为5组,假手术组、颈髓损伤后6,12,24,72h组,每组12只。①反转录-聚合酶链反应:颈髓组织总RNA提取各组分别取6只动物采用Trizol试剂提取组织总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的A260和A280值,判定RNA的纯度计算出总RNA的含量。第一链cDNA合成:取2μg总RNA于65℃变性3min,依次加入10×Buffer,25mmol/L氯化镁,10mmol/L2’-脱氧核苷三磷酸混合物,寡聚核苷酸引物和RNA酶抑制剂穴RNasin雪与反转录酶,总反应体积20μL,置42℃保温90min。②聚合酶链反应:取1/10体积穴7μL雪反转录液,分别加入200μmol/L2’-脱氧核苷三磷酸,50pmol/L寡聚核苷酸引物,0.5μL[α-32P]dCTP穴北京福瑞公司雪,1×Buffer,2.5UTaqDNA聚合酶。总反应体积为100μL。生长相关蛋白43的变性、退火和延伸温度分别为92,45,72℃,内皮素1所用的变性、退火和延伸温度分别为94,55,72℃,反应时间分别为1,2,3min,共进行35个循环。首次循环前先行94℃变性2min。最后一个循环于72℃延伸13min。反应完后取10μL反转录-聚合酶链反应的反应物行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。于紫外灯下切取含有聚合酶链反应产物的凝胶条带,用液体闪烁计数仪测定扩增物32P的放射强度。主要观察颈髓损伤后颈髓组织生长相关蛋白-43mRNA及内皮素1mRNA表达。结果:纳入动物60只,均进入结果分析。伤后6～72h颈髓组织生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA均较假手术组明显增高穴P<0.05雪。结论:颈髓损伤后生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA表达水平增加与伤后血脊髓屏障损害的发生、发展密切相关,生长相关蛋白、内皮素在颈髓损伤后血脊髓屏障损害的病理生理过程中起重要作用。