过氧化氢诱导血管平滑肌细胞内质网应激及其自噬作用

目的观察过氧化氢（H2O2）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）内质网应激及其自噬的作用机制。方法体外培养VSMC细胞,加入H2O250,100,200,400,600,800,1200和1600μmol·L-1分别作用12和24 h后,MTT法检测H2O2对VSMC的抑制率;倒置相差显微镜观察H2O2对VSMC细胞形态的影响;采用间接免疫荧光法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）和泛素结合蛋白p62的表达,采用Western蛋白印迹法检测自噬相关蛋白人卷曲螺旋肌球蛋白样BCL2相互作用蛋白/自噬基因（Beclin-1）和LC3、内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）及自噬上游信号通路哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（m TOR）的表达。结果 MTT结果显示,H2O250～1600μmol·L-1作用VSMC细胞12和24 h,VSMC细胞存活率明显降低,12和24 h的IC50分别为（597.2±2.3）和（447.4±1.7）μmol·L-1。倒置相差显微镜观察可见H2O2400μmol·L-1组VSMC收缩变圆。H2O2400μmol·L-1作用VSMC 12 h时,细胞存活率由（97.5±0.1）%下降至（74.4±1.0）%;作用VSMC 24 h,下降至（56.8±0.9）%（P<0.01）。激光共聚焦显微镜检测发现,H2O2400μmol·L-1作用VSMC 8 h,细胞浆中LC3和p62蛋白随H2O2作用时间的延长表达增加。LC3与p62的共定位显示,H2O2400μmol·L-1作用8 h最明显。Western蛋白印迹结果表明,H2O2诱导内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP和自噬相关蛋白Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著增加（P<0.01）,m TOR的表达显著降低（P<0.01）。结论 H2O2可能通过诱导VSMC内质网应激激活自噬。