免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向神经细胞定向分化

目的:利用免疫磁珠法分离成人骨髓神经生长因子受体阳性细胞,获得同质性骨髓间充质干细胞,并向神经细胞诱导分化。方法:实验于2005-01/08在吉林大学第一医院中心实验室完成。①骨髓来源于正常成人献髓者,由解放军三零七医院骨髓库提供。采用Percoll密度梯度离心法分离收集骨髓单个核细胞,分别进行常规贴壁分离及免疫磁珠分离。②常规贴壁分离法是将2×107骨髓单个核细胞接种于添加骨髓间充质干细胞培养液的25cm2培养瓶中孵育,48h后除去未贴壁细胞,更换新鲜培养液,待细胞生长至90%融合时消化传代。③免疫磁珠分离法是将骨髓单个核细胞先后与鼠抗人神经生长因子受体单克隆抗体、羊抗鼠IgG免疫磁珠4℃反应15min,然后将细胞放入分离系统的细胞分离柱内,经免疫磁珠标记的骨髓单个核细胞(神经生长因子受体阳性部分)由于磁场作用滞留于分离柱中。移走磁场后,冲洗分离柱即得到神经生长因子受体阳性细胞。④分别检测神经生长因子受体阳性细胞和常规贴壁培养所获骨髓间充质干细胞体外扩增和集落形成能力,分析其细胞表型和细胞周期,并将骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化。结果:①平均在每百个骨髓单个核细胞中有(2.6±1.2)个神经生长因子受体阳性细胞存在。经过免疫磁珠分离获得的神经生长因子受体阳性细胞数占骨髓单个核细胞总数的(0.57±0.31)%,纯度为(90.6±5.1)%。②神经生长因子受体阳性细胞培养4周后,神经生长因子受体、CD34、HLA-DR、CD133、CD105阳性率分别为(35.5±5.9)%,(2.3±1.7)%,(2.6±2.3)%,(1.4±1.1)%,(89.8±12.8)%。③经免疫磁珠分离获得的1×106个神经生长因子受体阳性细胞平均可以形成3100个集落,而接种同样数目的骨髓单个核细胞平均只能形成56个成纤维细胞集落。④神经生长因子受体阳性细胞可以在体外扩增10周,其扩增倍数较常规贴壁法纯化骨髓间充质干细胞平均高出2～3个数量级。⑤培养4周后,免疫磁珠法分离的骨髓间充质干细胞中处于分裂期的细胞比例高于常规贴壁法(12.37%,9.71%,P<0.05)。⑥诱导后5h,约60%细胞变成双极形、多极形和锥形,出现类似神经元细胞的形态,并可见多数细胞相互交织成网络结构。⑦经诱导分化后的骨髓间充质干细胞微管蛋白生物素单克隆抗体TuJ-1表达明显增强,无神经胶质纤维酸性蛋白表达。结论:①利用免疫磁珠分离骨髓神经生长因子受体阳性细胞可以获得同质性原始骨髓间充质干细胞。②免疫磁珠分离的神经生长因子受体阳性细胞较常规贴壁分离获得的骨髓间充质干细胞具备更强的增殖能力和成神经分化潜能。