油菜cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary]是引起油菜菌核病的病原真菌。核盘菌侵染植物细胞早期,可分泌一些细胞壁降解酶,如不同类型的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)。这些酶对病菌在植物组织上的定植起关键作用,同时酶活性的高低也决定病原菌的毒性或致病性。PG可以激活细胞的防卫反应而与其酶活性无关。为了解PG的信号转导途径,利用RT-PCR方法克隆了核盘菌的PG基因,将PG的编码区与酵母GAL4的DNA结合功能区融合,构建到酵母诱饵蛋白表达载体PGBKT7中;然后在酵母中构建了油菜cDNA表达文库。通过酵母双杂交方法在油菜cDNA表达文库中对与PG互作的蛋白进行了筛选,分离到一个与PG互作的蛋白,测序及BLAST分析表明该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域(C2-domain),推测该蛋白是一种钙依赖的膜结合蛋白。该蛋白与拟南芥中一个含C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达80.24%。利用半定量PCR分析了核盘菌诱导后该基因在油菜花、茎、叶中的表达,结果表明该基因在叶片中表达量最高。克隆到的C2蛋白与其他物种中的C2蛋白比较发现,与钙离子结合的天冬氨酸残基很保守。