t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法，在ｔ ＰＡｃＤＮＡ５′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽，与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组，构建表达质粒ｐＳＴＥ Ｙ，利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８，在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型，ＰＣＲ筛选ｔ ＰＡｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆，阳性克隆经甲醇诱导表达后，用ＳＤＳ ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右，用酪蛋白板溶圈法测定ｔ ＰＡ的活性。Ｍｕｔｓ表型菌表达产物活性最高为２５００ＩＵ／ｍｌ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达产物具有天然ｔ ＰＡ分子的免疫原性。