心脏连接蛋白43羧基末端相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

被引：8

作者：

梁庆

林吉进

李玉光

机构：

[1] 汕头大学医学院第一附属医院心内科

来源：

心脏杂志 | 2007年 / 03期

基金：

广东省自然科学基金;

关键词：

缝隙连接通道; 连接蛋白43; 心律失常; 蛋白质-蛋白质相互作用;

D O I：

10.13191/j.chj.2007.03.38.liangq.011

中图分类号：

R541 [心脏疾病];

学科分类号：

100201 [内科学];

摘要：

目的研究心脏连接蛋白43(Cx43)羧基末端与哪些心肌细胞内蛋白质存在相互作用。方法①通过PCR方法得到编码心脏Cx43羧基末端(AA235-382)的cDNA片段,并在其两端分别加上EcoRI和BamHI酶切位点,应用EcoRI/BamHI酶切PCR产物及pGBKT7空载体,凝胶分离后应用T4连接酶进行连接;②通过化学转化法将pG-BKT7-Cx43-CT转化酵母菌AH109;③通过“尿素/SDS”法从被转化的酵母菌中提取蛋白质;④应用抗C-myc抗体,通过Western blot方法检测”诱饵”蛋白的表达(即Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT融合蛋白);⑤检测”诱饵”蛋白自我激活报告基因与否后,将已被“诱饵“质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交,筛选阳性克隆分离阳性克隆中的cDNA,并测序。结果①诱饵载体测序结果证明pGBKT7中的“Gal4 DNA binding domain-C-myc”与Cx43的羧基末端在同一读框中;②“诱饵”质粒转化AH109酵母菌成功率100%;③从被转化的AH109中能提取到浓度满意的总蛋白;④Western blot能检测到特异性条带,其位置与Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT的分子量相当;⑤“诱饵”蛋白不能自激活报告基因Ade2和Mel1,但可自激活His3,5mmol/L的3-AT可有效抑制“诱饵”蛋白本身自激活报告基因His3,以利于下一步的杂交筛选,筛选得到10个准阳性克隆。结论心脏连接蛋白43羧基末端能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用,这些蛋白质可能参与对间隙连接通道的功能调控。

引用

页码：280 / 285

页数：6

共 3 条

[1]

Is the junctional uncoupling elicited in rat ventricular myocytes by some dephosphorylation treatments due to changes in the phosphorylation status of Cx43?.[J].Jean-Claude Hervé;Isabelle Plaisance;Jadranka Loncarek;Fabien Duthe;Denis Sarrouilhe.European Biophysics Journal.2004, 3

[2]

急性心肌缺血时连接蛋白43降解对传导速度影响的研究 [J].

林吉进 ;

李玉光 ;

谭学瑞 ;

曾欣 .

中国病理生理杂志, 2003, (06)

[3]

急性心肌缺血时连接蛋白43迅速降解的非均一性研究 [J].

李玉光 ;

林吉进 ;

王东明 ;

张元春 ;

卢成志 .

中华心血管病杂志, 2002, (09)

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