用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列，分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物，用ＰＣＲ技术，从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣ ＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中，分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体，获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明，该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点，而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明，质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒，插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。