茶树咖啡碱合酶cDNA在大肠杆菌中的表达

通过RT PCR法扩增出茶树咖啡碱合酶 (TCS)cDNA编码区全序列 ,并将其克隆到表达载体pET 32a (+)中 ,得到重组质粒pET TCS ,在表达宿主菌BL2 1trxB (DE3)中高效表达 ,产生相对分子质量约为 6 2 0 0 0的融合蛋白。该融合蛋白包括 112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及 370个氨基酸残基的茶树TCS蛋白。实验结果表明 ,随着诱导时间的延长 ,表达的融合蛋白产量逐渐增加 ,表达蛋白总量最高可达到菌体总蛋白的 39 14 % ;在 15、 2 5和 37℃ 3个不同的诱导温度下 ,均能诱导产生融合蛋白 ,而且产生的总量及其可溶性部分所占比例均随诱导温度升高而增加 ;在菌体的各个部位中 ,融合蛋白主要在细胞质中以可溶的形式进行表达 ,有少量在外周质中表达或以包涵体形式在细胞质中表达。另外 ,体外酶促反应表明 ,表达的融合蛋白能催化可可碱甲基化生成咖啡碱 ,具有正常的生物学活性。