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核酸诊断技术规范化的研究
被引：13
作者：
杨瑞馥
郭兆彪
张敏丽
汪晓辉
宋亚军
王津
机构：
[1] 军事医学科学院微生物流行病研究所!北京
[2] 军事医学科学院微生物流行病研究所!北
来源：
关键词：
聚合酶链反应;
微孔板杂交;
防污染;
酶免疫测定;
规范化;
D O I：
暂无
中图分类号：
Q503 [生物化学技术];
学科分类号：
071010 ;
081704 ;
摘要：
针对 PCR技术应用中的一些问题 ,从下述几方面开展了核酸诊断技术标准化的研究 :1探讨了设计引物的影响因素 ,发现根据同一基因设计的不同引物对 PCR敏感性影响较大 ,可相差 2 0倍 ,进一步研究表明 ,引物的自由能 ,尤其是引物 3′端 6个碱基的自由能可能决定着 PCR的敏感性 ;2研制成功室温稳定的 PCR试剂 ,将所有 PCR成分 (加入一种酶保护剂 )配制并分装于微量离心管中 ,并干燥 ,试剂室温放置 8个月 ,37℃破坏 2周对检测结果无任何影响 ;3因尿嘧啶糖基化酶( UDG)可特异降解 DNA双链中的尿密啶核苷 ,PCR体系中以 d UTP代替 d TTP,并在 PCR扩增前用 UDG消化 1 5 min,就可以特异防止 PCR产物的污染。对炭疽杆菌、鼠疫杆菌、土拉杆菌和布鲁氏菌扩增结果表明 ,0 .1 U的 UDG可完全消化 1 0 3～ 1 0 8个产物分子的污染 ;4建立了微孔板杂交技术代替电泳方法检测扩增产物 ,将 PCR产物克隆作为捕获探针包被聚乙烯微孔板 ,PCR引物5′末端生物素标记 ,扩增后作为待检测探针杂交 ,通过比较影响微孔板杂交的包被、杂交和显色等因素 ,建立了 PCR- EIA技术。通过比较包被缓冲液发现镁离子及其离子强度是影响 DNA包被的重要因素 ,包被的 DNA以线型质粒最佳 ,每孔包被 30 0 ng左右的 DNA杂交效果最好 ;杂交液中加和不加甲
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