乳酸克鲁维酵母高拷贝整合载体的构建及应用

用酿酒酵母２６ｓｒＤＮＡ作探针克隆了乳酸克鲁维酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓ２．２ｋｂｒＤＮＡ片段，对其作限制性内切酶图谱分析。以该基因片段为同源整合的靶顺序，酿酒酵母ＵＲＡ３基因为选择标记构建整合载体质粒ｐＩＲＫ，并对其在宿主Ｋ．ｌａｃｔｉｓＭＷ９８－８ｃ细胞中的整合位点，拷贝数及稳定性进行测定和分析。结果表明：质粒整合在转化子ＩＶ号染色体的ｒＤＮＡ位点；载体转化后的平均整合拷贝数约为１２０；在完全培养基上连续培养５０代，质粒稳定性这９５％－１００％。用载体ｐＩＲＫ表达外源基因ＬＡＣ４，实验表明，表达载体的稳定性好，拷贝数和表达量在一定程度上成正相关，转化子产生的半乳糖苷酶最高活性是Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ野生菌株所产生的８．６倍。