hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。方法:实验于2004-07/2005-12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养后以1μg PcDNA3.1-hVEGF165∶3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞,分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清,MTT法观察细胞增殖情况,以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。结果:①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组(P<0.05),但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组(P<0.05);而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。结论:①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF,且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下,转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。