里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

【目的】用分子改造的方法改造里氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考。【方法】用DNase I消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组。通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列。【结果】经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88%98%,确定为里氏木霉cbh1的基因片段。经DNase I消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因。将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库。从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1。序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置。【结论】改造后的cbhl基因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力。