应用表皮干细胞构建组织工程皮肤及移植实验

目的:探讨应用人表皮干细胞和猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法:实验于2004-06/2005-12在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①取环状切除后幼儿包皮(家属知情同意)用中性蛋白酶与胰蛋白酶混合消化液消化,收集细胞,接种在已包被Ⅳ型胶原的培养皿中,快速黏附,保留快速黏附细胞继续培养,培养体系为低钙高糖DMEM培养基,待融和状态时,再次消化,离心收集细胞,再次经过Ⅳ型胶原快速黏附,保留黏附细胞,培养20d左右,用作构建表皮干细胞并进行细胞鉴定。②将第2代细胞接种于铺好Ⅳ型胶原的猪无细胞真皮上,每3天换液。10d后将其转移至不锈钢网架上,行气液界面培养5d左右,构建复合皮。③取SD大鼠20只,随机分2组。于动物背部尾侧正中作2.5cm×2.5cm的全层皮肤至肌筋膜的切除。实验组10只创面覆盖表皮干细胞构建的复合皮移植物,对照组10只覆盖无细胞真皮移植物。④移植后7,10,14,21和35d,两组动物均活检取材,进行创面大体观察、组织学观察及免疫组织化学、免疫荧光鉴定等。结果:①表皮干细胞的分离、扩增及鉴定:在扩增的细胞拟接种于无细胞真皮前,进行角蛋白19免疫组织化学鉴定、以流式细胞术进行α6、CD71鉴定。经胶原Ⅳ黏附的细胞培养后形成较大集落,拟接种的种子细胞中α6briCD71dim细胞占总细胞的(39±7)%;鼠抗人角蛋白19阳性细胞率为(53±6)%。②组织工程皮肤的建立结果:表皮干细胞种植于无细胞真皮上1d后,细胞便贴壁并开始生长增殖,8d左右透过间隙见无细胞真皮上表皮干细胞渐增殖融合成片;2周时无细胞真皮表面可见菲薄皮片状生长的细胞膜片物。复合皮组织学检查可见无细胞真皮表面覆盖多层融合的表皮层细胞,无细胞真皮内细胞成分去除完全。③创面愈合情况:术后2周,实验组移植物成活,创面上已上皮化,移植物柔软,而对照组无细胞真皮表面未上皮化,较干燥,色暗、触之较硬,两组创面均未见明显收缩。4周,实验组创面愈合,未见明显排斥反应。对照组无细胞真皮干燥脱落而创面暴露,创面收缩明显,创面边缘因自体表皮细胞爬行而缩小创面。④组织学检查及免疫组织化学染色结果:实验组2周时创面已全部上皮化,但细胞分层少;3,4周表皮层分化良好,多层结构,真皮纤维内见成纤维细胞长入,见少许炎症细胞,大鼠自体正常皮肤见毛囊及毛发结构。对照组2周创面尚未上皮化,无细胞真皮干燥变性,3,4周后创面仍未愈合,可见大量炎症细胞。实验组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原直接免疫荧光染色呈阳性,证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成。而对照组阴性。实验组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色见整个表皮层细胞胞浆染呈棕黄,为阳性反应。结论:利用体外纯化扩增的表皮干细胞及制备的猪脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤,该组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。