ts-SV40LT抗原转基因干细胞增殖活性的温度调控机制分析

目的研究温度敏感性猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)转基因干细胞增殖活性的温度调控机制,为实现脑创伤患者在亚低温治疗期间实施干细胞移植奠定基础。方法用含ts-SV40LT抗原的表达质粒转染人源性脐带间充质干细胞(UCMSCs),PCR方法检测外源基因的整合效率,将其分别置于亚低温(33℃)和正常体温(37℃)下培养,细胞免疫荧光方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)活性,PCR-ELISA端粒酶检测法检测端粒酶活性,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测细胞周期调控蛋白——周期素D1(Cyclin D1)、CyclinE、周期素依赖性蛋白激酶-2(CDK2)、CDK4、CDK6、P16和P21的蛋白表达情况,免疫荧光方法检测巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;SPSS13.0软件进行统计学分析。结果 PCR结果显示ts-SV40LT抗原的基因片段被成功整合入干细胞,该细胞株在33℃条件下增殖生长旺盛,端粒酶活性高,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6均高表达,P16和P21低表达,同时高表达nestin,不表达NSE和GFAP;在37℃条件下细胞增殖缓慢甚至停滞,端粒酶活性低,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6的表达强度明显低于33℃条件,P16和P21则相反,与此同时nestin表达强度明显下降,NSE和GFAP表达水平上升。结论通过ts-SV40LT抗原基因的有效转染可实现干细胞在不同温度环境下的增殖调控,为在亚低温条件下实现干细胞移植救治颅脑创伤患者提供了实验支持。