TGF-β1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路。方法6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150g。扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序。采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组)。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs原代细胞接种24h后可见少量贴壁突起细胞,4、5d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一。免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应。转染24h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显。MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655±0.045和0.833±0.103。A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.9250±0.0220、124.3417±2.9820,E组次之,分别为0.7717±0.0120、101.7667±1.2410(P<0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.0260、128.1717±9.1520,D组次之,分别为0.4650±0.0420、111.0450±6.2480(P<0.01);II型胶原表达以E组最多,分别为0.9800±0.0340、120.3550±12.5500,C组次之,分别为0.7200±0.0260、72.2467±7.3640(P<0.01)。结论通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。