大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察

目的对体外培养大鼠软骨细胞复制性老化行为进行观察,为进一步研究组织工程软骨退变机制,以及用药物干预并逆转其退变提供实验参考。方法4周龄SD大鼠,体重185～200g,断颈处死,分离培养软骨细胞,采用组织化学法检测传代培养的P1、P2、P3及P4代软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶,透射电镜观察细胞结构,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸糖胺多糖(sulfat-glycosaminoglycan,GAG)含量和分子结构,RT-PCR方法检测软骨细胞型胶原表达,流式细胞仪分析细胞周期及增殖指数(proliferative index,PI)。结果β-半乳糖苷酶检测:P1、P2代软骨细胞偶见阳性染色;P3代可见少数细胞阳性染色,与P1、P2代比较差异有统计学意义(P<0.01);P4代与P1～P3代比较,阳性染色显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。透射电静镜观察:P1、P2代细胞胞浆内细胞器较多,胞核及核仁清晰,无凋亡软骨细胞;P3代细胞核浆比较大,胞浆内细胞器减少,胶原网络结构模糊不清;P4代细胞核浆比例增大,核固缩。P4代细胞G0/G1期含量增加(83.8%),而P1、P2及P3代分别为79.1%,79.2%,80.8%。P4代细胞PI为16.2%,P1、P2、P3代PI分别为20.9%、20.8%、19.2%。PCNA表达、GAG含量、长链分子百分比、型胶原表达减少等指标P4代与前代比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的大鼠软骨细胞P4代出现老化。