基于vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究

目的建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的TaqMan实时荧光定量PCR。方法采用Primer Express软件,设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针,建立检测创伤弧菌vvhA基因100 bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。采用基因克隆技术,构建作为阳性对照的pMD19-vvhA100重组质粒。以最低扩增循环数(Ct值)、荧光强度增加值(△Rn)为观察指标,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化。以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhA100为模板,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证。创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠,验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果。结果所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果,其检测灵敏度可达0.01ng创伤弧菌DNA或10～3个拷贝的pMD19-vvhA100,不同浓度pMD19- vvhA100三次检测结果的SD≤0.79,对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性。结论所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点,适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。