体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)生成高纯度神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的方法。方法模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,以脑星形胶质细胞为支持细胞,用全反式维甲酸(All-transretinoicacid,ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定;形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测;NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果⑴体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养,仍保持向三胚层分化的能力;⑵随着诱导的进行,OCT-4表达逐渐减弱并消失,而Nestin表达逐渐增强,经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的Nestin阳性细胞;⑶所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代,仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力,在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质,模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。