切刻内切酶介导恒温扩增技术条件优化

被引：3

作者：

王纪东 ^{[1
]}

王小慧 ^{[2
]}

李媛 ^{[2
]}

张娟琨 ^{[1
]}

詹林盛 ^{[2
]}

机构：

[1] 天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室教育部工业微生物重点实验室

[2] 军事医学科学院野战输血研究所

来源：

军事医学 | 2012年 / 36卷 / 01期

关键词：

切刻内切酶; 恒温扩增; NEMA; 核酸扩增技术;

D O I：

暂无

中图分类号：

R346 [];

学科分类号：

1001 ;

摘要：

目的采用切刻内切酶介导恒温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification,NEMA)扩增蜡样芽孢杆菌质粒,考察缓冲体系、温度、离子浓度等条件对扩增效率的影响。方法通过独特的引物设计,采用NEMA技术扩增蜡样芽孢杆菌质粒,通过系列实验优化了缓冲体系、温度和离子浓度等条件,采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。结果通过设计不同长度片段的扩增产物,证明采用NEMA技术进行恒温扩增引物设计的正确性。扩增反应中,缓冲体系的组成、扩增温度、体系镁离子及二甲基亚砜(DMSO)的浓度会影响切刻内切酶恒温扩增效率,而海藻糖添加与否在本实验中与扩增效率无关。在最优条件下,NEMA恒温扩增方法对于蜡样芽孢杆菌质粒的灵敏度达到1.7 pmol/L。结论 NEMA可以用来进行较长片段的扩增,有望成为一种常规的恒温扩增技术,应用到战时或者应急条件下的快速核酸诊断中。

引用

页码：65 / 69

页数：5

共 6 条

[1]

切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用[P]. 尤其敏;胡林;汪净;钟华燕.中国专利:CN1850981A,2006-10-25

[2]

Cloning of CviPⅡnickingand modification system from chlorella virus NYs-1 and applicationof Nt.CviPⅡin random DNA amplification. Chan SH,Zhu Z,Van Etten JL,et al. Nucleic Acids Research . 2004

[3]

Isothermal DNA ampli-fication using the T4 replisome:circular nicking endonuclease-de-pendent amplification and primase-based whole-genome amplifica-tion. Schaerli Y,Stein V,Spiering MM,et al. Nucleic Acids Research . 2010

[4]

炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 乔岩梅.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007

[5]

Trehalose is a potent PCR enhancer: lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by the disaccharide trehalose. Spiess,AN,Mueller,N,Ivell,R. Clinical Chemistry . 2004

[6]

BstnbⅠnicking en-donuclease and methods for using endonucleases in single-strandeddisplacement amplification. Kong H,Higgins LS,Dalton MA,et al. United States Patent,US 2003 /0211506A1 . 2003

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