肝细胞移植实验研究中大鼠肝细胞的冻存与复苏初探

目的　以大鼠为实验对象 ,研究冷冻复苏及降温速率对肝细胞活率、形态和功能的影响。方法　改良Seglen门静脉 下腔静脉双插管胶原酶灌注法分离获取游离肝细胞。分别将肝细胞按B程序 (渐进式降温程序 :- 1 5℃ /min至 - 18℃ ,保持 5min ,- 2 0℃ /min至 - 80℃ ,投入液氮保存 ) ;C程序 (慢速线形冷冻程序 :- 2 5℃ /min至 - 80℃ ,投入液氮保存 )进行处理。 2组冻存细胞分别在液氮中冷藏 3、15、30d后 ,40℃水浴复苏。检测复苏肝细胞活率、形态结构、蛋白质合成功能的改变。结果　 (1)B组、C组冻存后各时间点细胞活率及 3H 亮氨酸合成量较新鲜组 (A组 )均有明显下降 (P <0 0 0 1) ,C组明显低于B组 (P <0 0 0 5 ) ,2组各组内在不同时间点的活率及 3H 亮氨酸合成量无明显差别 (P >0 0 5 )。 (2 )光学显微镜下见复苏细胞与新鲜细胞无明显区别。电子显微镜下可见B、C组细胞超微结构有明显改变 ,但B组程度较C组轻。结论　降温速率的快慢直接关系冻存肝细胞的效果。冷冻复苏过程使细胞膜完整性受损、细胞质内容丢失导致细胞在复苏后活率降低、细胞功能丧失。肝细胞在液氮中保存 ,其活率及蛋白质合成功能并不随保存时间的延长而降低。