腺病毒介导转染hTGF-β1基因的兔脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨腺病毒介导转染hTGF-β1（Ad-hTGF-β1）基因的兔脂肪干细胞（ADSCs）在体外定向诱导分化成软骨细胞的可行性。方法含增加型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因）的腺病毒表达载体pAd-hTGF-β1,经293细胞包装重组腺病毒后,感染第3代培养的兔ADSCs。将转染与未转染hTGF-β1的ADSCs置于诱导培养液（CMM液）中行单层培养和包埋于藻酸钠微珠支架中行三维立体培养,定期观察细胞的大体形态学变化、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因hTGF-β1的表达及RT-PCR法、Western blot法和免疫组织化学法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原蛋白（CollagenⅡ）的表达。结果转染hTGF-β1组的ADSCs在单层培养中呈现形态规则、多角型细胞增多、增殖能力明显增强;转染后7d与21d在三维藻酸钠微珠支架中培养的ADSCs的hTGF-β1基因表达均明显升高,其RT-PCR结果与未转染组比较差异有统计学意义（P<0.01）。同时转染组的兔ADSCs分泌CollagenⅡ明显增多,转染后7d与21d的CollagenⅡRT-PCR、Western blot和免疫组织化学结果均明显高于未转染组（P<0.01）,并且转染组内其表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论经Ad-hTGF-β1基因修饰的兔ADSCs在体外不需外来生长因子诱导下能定向分化成软骨细胞,且其分化能力强,外来基因hTGF-β1表达高、持续时间长,是理想的软骨组织工程的种子细胞,这也为转基因干细胞治疗软骨缺损提供理论依据。