含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验(英文)

背景:体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。目的:观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。设计:单一样本观察。单位:四川大学生命科学院细胞生物学实验室。材料:孕14dSD大鼠10只,DMEM/F121∶1,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG,胶质纤维酸性蛋白抗体IgG,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。方法:实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组:加入DMEM/F12(1∶1)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组:培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组:培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组:先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶,培养14d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。主要观察指标:①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。结果:①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%)。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。结论:①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。