血管性血友病因子抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的建立检测人血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法用配对的VWF抗体进行棋盘滴定来确定最佳捕获抗体和检测抗体浓度,建立检测人VWF抗原含量的双抗体夹心ELISA方法;用VWF国际标准品（NIBSC07/316）标定内控标准品（无FⅧ的VWF）,确定VWF∶Ag的国际单位（Ag/ml）与质量单位（μg/ml）的关系;对建立的方法进行线性、准确度、精密度、样品稳定性验证;将验证后的该方法用于FⅧ纯化工艺的监控及产品质量分析。结果捕获抗体和检测抗体稀释度均为1∶200;VWF∶Ag的1 Ag/ml对应16μg/ml;标准曲线的线性范围为160～10 ng/ml,各浓度回收率在95.8%103.2%之间,变异系数（CV）<5%,R2≥0.99;不同浓度样品检测结果的批内回收率在93.0%113.9%之间,批间回收率在95.1%105.5%之间;批内CV在0.7%8.2%之间,批间CV在3.8%9.6%之间;样品添加试验的回收率在96.9%114.7%之间。具有生物学活性的样品应-80℃冻存,复融1次后立即检测;国药集团武汉血液制品有限公司FⅧ纯化工艺中PEG沉淀和离子交换层析去除了95%以上的VWF,工艺稳定性较好,成品具有与血浆接近的FⅧ∶Ag/VWF∶Ag比值。结论建立的人VWF抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的线性、准确度和精密度。用该方法进行VWF的抗原含量检测可作为FⅧ纯化工艺内部质量控制的一个指标。