人细胞色素P450 1A2的异源表达及代谢活性测定

目的获得单一的具有活性的人细胞色素P450 1A2(CYP1A2)重组酶,以进一步进行该酶参与的药物代谢研究。方法以人肝组织提取的总RNA为模板,RT-PCR扩增全长的人类CYP1A2基因片段,插入转座载体pFastBac构建重组转座质粒pFastBac-CYP1A2,转化入DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CYP1A2,以之转染草地夜蛾细胞(Sf9),与细胞色素氧化还原酶(CYPOR)进行共表达。利用蛋白质印迹分析鉴定其表达,并以非那西丁为底物,利用HPLC对其进行代谢活性测定。结果蛋白质印迹分析表明人CYP1A2蛋白在Sf9细胞中成功表达,且该重组酶对非那西丁的Km值为(82.04±11.39)μmol·L-1(n=3),Vmax值为(1.78±0.26)nmol·min-1·mg-1蛋白(n=3),表观清除率Clint值为0.02mL·min-1·mg-1蛋白。结论利用杆状病毒/昆虫细胞系统,可获得具代谢活性的人CYP1A2重组酶,该酶可进一步用于其他底物的I相代谢研究。