桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板，用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增，得到１．３ｋｂ左右的扩增产物，将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上，组建亚克隆并进行序列测定，结果表明，该基因全长有１２８８个碱基，由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成，编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％，８３．０％，７６．８％，７４．０％，７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明，该基因在未成熟果实检测不到杂交信号，随着成熟度增加，硬度下降，基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中，并通过酶切分析，ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。