目的:研究黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨细胞基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3mRNA表达的影响。方法:取膝骨关节炎患者膝关节软骨进行细胞培养,将培养的软骨细胞分离传代后取第3代细胞,通过HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定,并进行基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3免疫荧光染色。观察软骨细胞退变情况后将其分为6组,A组不进行干预;B组加入25 mmol.L-1黄芪甲苷;C组加入50 mmol.L-1黄芪甲苷;D组加入75 mmol.L-1黄芪甲苷;E组加入100 mmol.L-1黄芪甲苷;F组加入500 mmol.L-1黄芪甲苷。分别于培养开始后4 h、8 h、24 h、48 h、72 h 5个时间点,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组退变软骨细胞内基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3mRNA表达的情况。结果:①形态观察。原代细胞中梭形细胞和多角形细胞并存,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,细胞纤丝较长。HE染色细胞质为红色,胞膜呈蓝色;甲苯胺蓝染色细胞质和胞膜均呈深蓝色;Ⅱ型胶原染色阳性为绿色荧光,细胞核采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚复染,在不同波段荧光激发下,胞浆和胞膜可见清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光,证明培养细胞表达特征性基因Ⅱ型胶原,主要分布在胞浆和细胞膜上,证明所培养的细胞为软骨细胞。基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3免疫荧光染色可见清晰绿色荧光,软骨细胞以多角形多见。②基质金属蛋白酶-1mRNA表达。不同时间点间软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA表达水平有差异(F=11.027,P=0.000);不同组间软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA表达水平有差异(F=102.345,P=0.000),A组高于B组、C组、D组、E组(P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000),F组高于A组、B组、C组、D组、E组(P=0.009;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000);时间因素和组间因素存在交互效应(F=8.258,P=0.000)。③基质金属蛋白酶-3mRNA表达。不同时间点间软骨细胞基质金属蛋白酶-3mRNA表达水平有差异(F=12.316,P=0.000);不同组间软骨细胞基质金属蛋白酶-3mRNA表达水平有差异(F=66.112,P=0.000),A组高于B组、C组、D组、E组(P=0.008;P=0.000;P=0.000;P=0.000),F组高于A组、B组、C组、D组、E组(P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000);时间因素和组间因素存在交互效应(F=14.846,P=0.000)。结论:低浓度的黄芪甲苷能通过抑制退变软骨细胞合成基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3,延缓软骨细胞退变;浓度过高则会促进退变软骨细胞合成基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3,加速软骨细胞退变。
