体外培养兔骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙的肌内成骨能力观察

目的:观察体外成骨诱导培养液条件下骨髓基质干细胞与细胞支架β-磷酸三钙体外复合培养后的成骨活性,以验证兔骨髓基质干细胞在体外向成骨细胞转化的能力,并进行对照比较。方法:实验于2003-10/2004-02在解放军第二军医大学长征医院骨科实验室完成。取健康成年新西兰大白兔7只,将抽取的骨髓置于加入地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C的DMEM标准培养液中培养。对获得的兔骨髓基质干细胞以倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等手段进行生长状态观察及生物学特性鉴定。然后将骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙体外复合培养1周后自体回植兔肌肉内,分别在4周和8周后取材,观察其成骨能力以组织学方法检测,并与未复合的β-磷酸三钙的细胞做自身对照比较。结果:实验选取的7只兔全部进入结果分析。①细胞的生长状况及形态特征:细胞全骨髓法培养24～48h,细胞开始贴壁,呈短梭形,贴壁细胞呈成纤维细胞集落方式生长。细胞培养5～7d,细胞集落生长逐渐密集,细胞体积逐渐增大,向长梭形转变,部分细胞呈多角形。②细胞生长曲线:传至第3代细胞,1～3d细胞增殖缓慢,为潜伏期,3～5d后细胞大量扩增,6d后细胞达到顶点进入平台期。第1,2,4代细胞的生长曲线基本与第3代相似。③细胞贴壁率:各代细胞的贴壁率未见明显差异,一般2h开始贴壁,2～8h前贴壁率增加较快,8～14h贴壁率达80%～90%。④细胞分裂指数:细胞早期分裂较慢,培养5～8d分裂指数最高,可达10%～15%。表现为胞核增大,双核增多。1～4代核分裂率基本相似。⑤细胞超微结构观察。结果:培养至第2代,骨髓基质干细胞透射电镜下细胞内开始出现大量胶原。⑥血清碱性磷酸酶检测结果:骨髓基质干细胞染色后,血清碱性磷酸酶显示红棕色沉淀,细胞密集区颜色较深。第3代细胞血清碱性磷酸酶染色阳性率可达85%以上。⑦细胞免疫组化Ⅰ型胶原检测结果:各代细胞I型胶原免疫组化染色均为阳性,胞浆呈红棕色。⑧肌内成骨活性观察:骨髓基质干细胞/β-磷酸三钙复合物植入体内4周,可见新生骨样基质。8周后新生骨量明显增多,可见典型的骨组织结构。而未复合细胞的人工骨孔隙内仅见大量纤维结缔组织,体内培养4周及10周时均未见骨组织形成。结论:体外培养条件下,骨髓基质干细胞在条件培养液中具有与成骨细胞相似的形态特征、生长特点和功能性表现,短期内可以获得大量具有成骨能力的细胞。复合β-磷酸三钙载体后,出现异位成骨现象,为临床骨组织工程技术的研究提供了理论依据和参数。